二、TOPO克隆PCR产物的纯化回收

1. PCR反应完成后，需通过琼脂糖凝胶电泳鉴定产物，确认是否存在目标大小的条带。

2. 推荐采用切胶回收的方式进行纯化。切胶时间最好控制在3分钟以内，以避免紫外线对DNA造成损伤。使用NanoDrop或OneDrop等仪器检测回收浓度，要求浓度≥30ng/μl，并通过跑胶确认仅存在目标条带。

目的片段连接至载体：

1. 按照说明书要求准备连接反应体系，各组分的投入体积需≥1μl；若浓度过高可适当稀释。

2. 连接反应的温度可尝试在25°C或37°C，时间为5分钟；若出现克隆失败或克隆空载体/假阳性情况，建议将时间延长至30分钟。

感受态细胞转化及涂板：

1. 选择DH5α、Fast-T1等化学感受态细胞进行连接产物的转化。

2. 感受态细胞不能反复冻融，建议从-80°C取出后一次性使用。

3. 重组产物体积与感受态细胞体积的比例为1:10，推荐使用10μl重组产物加入至100μl感受态细胞，或5μl重组产物加入至50μl感受态细胞。

4. 热激时间应遵循感受态细胞说明书进行操作。

5. 平板的抗生素抗性需要与转化载体的抗性保持一致。

6. 对菌液进行离心（2500×g，3min），吸取后弃去多余的LB培养基，保留100μl重悬后全部涂板；或吸取适当体积进行涂布。

单克隆菌落PCR鉴定：

1. 从平板中挑取体积适中的单克隆菌落，避免过大或过小的选择。

2. 挑取多个单克隆菌落进行鉴定分析。

3. 将挑取的菌落放入已加入10μl ddH2O的15ml或2ml EP管中，充分溶解混匀后吸取1-2μl作为PCR反应（10/20μl体系）的模板。

4. 推荐使用一对分别位于片段和载体的上下游引物进行PCR鉴定。

在进行目标片段处理的同时，如模板存在Amp/kana抗性的质粒，我们建议进行切胶回收。

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