蛋白质含量测定实验概述

本实验旨在运用LOWRY法精确测定蛋白质的含量，以支持生物医学研究中的各种分析需求。

实验原理

LOWRY法结合了双缩脲法与福林酚法，其基本原理为：将蛋白质溶液与碱性铜溶液相处理，形成铜-蛋白质的络合物，随后再加入酚试剂。这一过程不仅使肽链中酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸等显色，同时增强了双缩脲法中肽键与碱性铜的显色效果。因此，与单独使用酚试剂相比，LOWRY法的显色效果可提高3到15倍，甚至在双缩脲法中达到100倍的增强作用，显著降低不同蛋白质种类引起的测定偏差。

LOWRY法的试剂包含两部分：试剂甲，是双缩脲试剂（碱性铜溶液），用于与蛋白质中的肽键发生显色反应；试剂乙则是磷钨酸与磷钼酸的混合液，在碱性条件下极不稳定，容易被酚类化合物还原为蓝色的钼蓝和钨蓝混合物。此反应使得蛋白质中的酪氨酸和胱氨酸等显色，颜色深浅与蛋白质含量呈正比。

主要试剂与设备

主要试剂包括：

• Na2WO4•2H2O
• Na2MoO4•2H2O
• 85% H3PO4
• 浓 HCl
• Li2SO4•H2O
• 溴水
• 酚酞指示剂
• Na2CO3
• NaOH
• CuSO4•5H2O
• 酒石酸钾钠
• 牛血清白蛋白（配成250 mg/ml的溶液）

主要设备包括：

• 试管若干
• 刻度吸管（0.5 ml, 1 ml, 10 ml）
• 定量加样器
• 圆底烧瓶
• 冷凝管
• 微量滴定管
• 小烧杯
• 微量进样器（50 μl）
• 分光光度计

实验步骤

1. 酚试剂的制备

(1) 在1500 ml的圆底烧瓶中，加入Na2WO4•2H2O（100 g）、Na2MoO4•2H2O（25 g）及蒸馏水（700 ml），然后加入85% H3PO4（50 ml）和浓 HCl（100 ml）。装上回流冷却装置，慢慢加热至沸腾，持续10小时。冷却后，加入Li2SO4•H2O（150 g）、水（50 ml）和浓 HCl（100 ml），继续回流加热15分钟以挥发多余的溴，并在冷却后稀释至100 ml，用棕色瓶过滤保存于冰箱中。使用时需用标准NaOH溶液进行滴定，终点应由蓝色变为灰色。

(2) 配制所需溶液，包括4% Na2CO3溶液、0.2 mol/L NaOH溶液、1% CuSO4溶液及2% 酒石酸钾钠溶液。将Na2CO3溶液与NaOH溶液等体积混合，形成Na2CO3-NaOH溶液。再将CuSO4溶液与酒石酸钾钠溶液等体积混合，按50:1比例将两者混合，形成Folin-酚试剂甲液，该试剂应在一天内使用完毕。

2. 标准曲线的绘制

(1) 准备7只试管，依次加入0 ml、0.1 ml、0.2 ml、0.4 ml、0.6 ml、0.8 ml及1 ml的标准蛋白质溶液，用水补足至1 ml，形成标准系列（含蛋白质量分别为0 mg、25 mg、50 mg、100 mg、150 mg、200 mg、250 mg）。（必要时可进行重复实验）

(2) 加入5 ml试剂甲，充分混匀后，在30℃下放置10分钟。

(3) 迅速加入0.5 ml试剂乙，立即振荡混合，并在30℃下恒温反应30分钟。

(4) 30分钟后，以未加标准蛋白管作为空白，在500 nm波长下测定吸光度值。

(5) 以蛋白质浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。

3. 样品测定

(1) 取50 μl样液加入试管中，按0.1 g鲜样/ml的比例提取，加蒸馏水补至1 ml，然后重复步骤2（2），（3），（4），以空白作为参比，测得吸光度值。

(2) 根据测得的吸光度值，利用标准曲线计算样品中的蛋白质含量。

4. 结果计算

蛋白质含量（mg/g鲜重）= (C*V/a)/W

其中，C为样品测定管中的蛋白质含量（mg）；V为提取液总量（ml）；a为测定时取样液量（ml）；W为取样量（g）。

注意事项

1. Folin试剂乙在酸性条件下稳定，因此加到碱性的铜-蛋白质溶液中时，需立即混匀，以保障还原反应的发生。

2. 为确保反应的完全性，应在25至30℃的水浴中进行反应，30分钟后准时进行比色测定。

3. 注意还原物质对实验的干扰。考马斯亮蓝法与LOWRY法均为灵敏度达到微克级的高灵敏度蛋白质定量测定技术，前者稳定性较好，而后者操作简便。虽然两者各有缺陷，但对比其他现有方法均具有更优的性能。特别是LOWRY法容易受到植物中酚类物质的干扰，而考马斯亮蓝法在高蛋白质含量时，线性关系可能稍有偏差。

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