### 培养条件

气相条件为95%空气和5%二氧化碳，温度设置在37℃。

### 传代方法

首次传代建议采用1:2的比例。在传代期间，每两天更换培养液。建议在购买细胞的同时，购买尊龙凯时的完整培养基，享受优惠。收到细胞后，若其状态良好，需灌满培养液并封好瓶口以保证运输安全。

### 收到细胞后的处理

收到细胞后，请使用75%酒精对整个细胞瓶进行消毒处理，之后将其放置于超净工作台内，严格执行无菌操作。接着，将细胞瓶放入37℃、5% CO₂培养箱中静置3-4小时，以稳定细胞状态。随后，使用显微镜观察细胞生长情况，并对细胞在不同放大倍数下进行拍照（建议40x、100x、200x各一张）。前三天的照片是重要的售后依据，若不提供照片，将默认细胞状态良好。

### 细胞培养步骤

#### 细胞传代

如果细胞汇合度未超过80%，请将瓶内的完全培养液收集至离心管中，保留5ml培养基，与37℃、5% CO₂孵箱培养；如果细胞密度超过80%，即可进行传代。

贴壁细胞传代步骤如下：

1. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS对细胞进行1-2次冲洗。
2. 添加约1-2ml的0.25%胰蛋白酶消化液至培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，之后在显微镜下观察细胞消化情况，若大部分细胞变圆并开始脱落，迅速将其移至操作台，轻轻敲打培养瓶后加入超过5ml的完全培养基以终止消化。
3. 轻轻吹打细胞至完全脱落，然后吸出悬液，转移至15ml离心管中，在1000RPM下离心5分钟，弃去上清液，补加1-2ml完全培养基重悬。
4. 将细胞悬液按1:2的比例分瓶（两个T25瓶），补充新的完全培养基至每瓶5-8ml，最后将其放入37℃、5% CO₂培养箱中继续培养。

#### 悬浮细胞传代步骤

1. 半换液法：竖直放置培养瓶在培养箱静置约1小时，轻轻吸掉3ml培养基，然后补入3ml完全培养基；如果培养基变色缓慢，可直接添加约500μl FBS。传代时直接补入5ml的培养基分成两个培养瓶，通常进行3次半换液后可进行离心传代以去除死细胞。

2. 离心换液法：如需分瓶，请将细胞悬液收集至离心管中，在1000RPM下离心5分钟，弃去上清，加入1-2ml培养液重悬混匀，然后将细胞悬液按1:2比例分至新的T25瓶中，添加6-8ml按说明书配置的新完全培养基，以保持细胞的活力。后续传代可按照实际情况调整为1:2到1:5的比例。

### 细胞冻存

1. 当细胞生长至覆盖培养瓶80%面积时，弃去T25培养瓶中的培养液，用PBS清洗一次细胞；

2. 添加约1ml的0.25%胰蛋白酶消化液至培养瓶中，观察细胞回缩变圆后，加入5ml完全培养基以终止消化，再轻轻吹打细胞使其脱落，将悬液转移至15ml离心管中，1000RPM离心5分钟；

3. 弃去上清，加入1ml的尊龙凯时无血清冻存液（货号：C7001）进行混匀后转入冻存管中。

4. 将冻存细胞直接放入-80℃冰箱。如果后期需要转移至液氮罐中，请在-80℃冰箱中存放24小时以上后再进行转移。

### 细胞复苏

1. 从液氮中取出细胞冻存管（注意佩戴保护面具），迅速将其置入37℃水浴中解冻，直到冻存管内无结晶后，使用75%酒精擦拭冻存管外壁；

2. 将冻存管中的细胞转移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，1000RPM离心5分钟；

3. 弃去上清，使用5ml完全培养基重悬细胞，接种至T25培养瓶中，并放入37℃、5% CO₂培养箱中继续培养；

4. 第二天更换为新鲜的完全培养基以继续培养。

### 注意事项

在运输过程中，有些细胞可能由于黏附不牢而发生脱落，这属于正常现象。如发生严重脱离，可将培养瓶内的培养液收集至离心管中，1000RPM离心5分钟，收集上清作为过渡培养（用于后期的对比培养）。沉淀细胞后加入1-2ml胰酶，轻轻吹打，重悬并消化1-2分钟后，加入5ml完全培养基终止反应。再次离心，弃去上清后，重悬细胞，按1:2比例进行分瓶传代（两个T25），补充新的完全培养基至每瓶5-8ml，最后放入37℃、5% CO₂培养箱中进行培养。